ガン治療とメシマコブ

進行ガンでも最後まであきらめてはいけない。

ガンの治療の選択肢は大変多くなりました。病院ごとに得意な治療方法があると言ってもいいほどです。

メシマコブの特許に関する説明を特許電子図書館から取得し、その一部（発明の効果・詳細な説明）を記載したものです。

表　は省略しておりますので、ご覧になりたい方は特許庁のホームページから
（特許　第３０９３１９４）を検索してください。
効果 —————————————————————–
【発
明の効果】本発明は、以上の実施例と実験例にて説明した通り、多様なペリヌス属菌株からミトコンドリアＤＮＡを分離して制限酵素で処理した後、ＲＦＬＰ
(restriction fragment length
polymorphism)結果を分析し、微生物学的特徴を調べることにより新規のペリヌス・リンテウス・ユー(Phellinus linteus
Yoo)菌株を同定し提供するものである。同定した新規のペリヌス・リンテウス・ユー菌株を始めとするペリヌス属菌糸体からT-細胞とB-細胞リンパ球の
それぞれに対する細胞毒性作用と免疫作用体である抗体形成を誘導して免疫活性を増加させることにより抗癌免疫活性を示す多糖類物質を提供すること、ならび
に、この多糖類物質が抗癌免疫治療剤として生体の免疫機能を増加させて癌移転を抑制することにより、癌、AIDS等の免疫関連疾患の予防及び治療に効果が
あるため、生物医薬産業及び免疫学上非常に有用である。
詳細な説明 ——————————————————-
【発明の詳細な説明】

【０００１】
【発
明の属する技術分野】本発明は、新規の免疫増強活性多糖類物質を生産するペリヌス属菌株と、この菌株が生産する多糖類物質及びこの物質の使用に関する。よ
り具体的には、本発明の多糖類物質は、新規の免疫増強活性を示す多糖類物質を生産するペリヌス属(Phellinus)菌株を同定し、同定した菌株とペリ
ヌス属菌株の菌糸体又は子実体から新規の免疫増強活性多糖類物質を分離精製することによって得ることができる。分離された多糖類物質は、癌、ＡＩＤＳ等の
免疫関連疾患の予防・治療、ならびに、それら疾患の機序の基礎研究のための薬物として使用し得る。

【０００２】
【従来の技術】真菌類の高等菌類に属する茸は、顕微鏡的構造の菌糸により外部から栄養の供給を受けて従属栄養生活をし(Whittaker,1969)、
生態界内では複雑な有機物質を分解して自然に還元させる分解者の役割を担当する。典型的な茸の種類は、大部分の菌類中でも担子病を形成して四つの担子胞子
を外生する担子菌類(Basidiomycetes)に属し、担子菌類中でも子実層を露出して胞子を能動的に放出する菌蕈類
(Hymenomycetes)に属する。菌蕈類の代表例は、平はら茸目(Aphyllophorales)とはら茸目(Agaricales)であり、
平はら茸目には箒茸、すずめの茸、はり茸、かわら茸、あな茸、さるのこしかけ等の種類があり、はら茸目には平茸、椎茸、末広茸、松茸、べんてん茸、はさく
れしとよ茸等の種類が代表的である(李
等、１９８５)。担子菌の一種で平はら茸目(Aphyllophorales)に属する茸類の多くの種類が各種の疾病、特に腫瘍に対する治療効果があると
の事実が以前から知られており、主に漢方薬又は民間薬として伝承されて来た。その中でもさるのこしかけ科(polyporaceae)のすっぽん茸属
(Phellinus)に属するペリヌス・リンテウス(Phellinus
linteus)は、漢方では桑黄と呼ばれる貴重な薬材として用いられて来た。しかし、桑黄は自然界では非常に稀貴種であって、子実体(fruiting
body)の入手が極めて難しいのみならず、菌糸体(mycelium)を分離して人工培養するのも極めて難しいという欠点がある。従って、桑黄が腫瘍治
療剤として非常に効果があるとの事実が認知されていたにも拘わらず積極的に活用することができなかった。

【０００３】癌を治療するための方法としては、化学療法(chemotherapy)、放射線療法
(radiotherapy)、手術療法(surgery)等が用いられているが、これら治療法は、効果的に固形癌等を除去することができるが、癌を完全
に治療することができなく、特に癌の転移に対しては治療効果が低い。更に、アドリアマイシン等のような抗癌剤を用いる化学療法及び放射線療法は、甚だしい
副作用を誘発する。副作用を減少させるために抗癌剤の量を減らして癌を治療することもあるが、この場合、治療効果が低まる欠点がある。より大きい問題点と
しては、前述の通り、抗癌治療後に癌転移を抑制し得ないということである。従って、既存の化学療法による抗癌治療は癌細胞の成長を抑制する効果があるが、
癌を完治することはできなかった。

【０００４】最近、免疫療法(immunotherapy)を化学療法と共に用いて抗癌効果を高め、副
作用を減少させる方法が用いられている。即ち、免疫増強剤とアドリアマイシン等の抗癌剤を併用(immunochemotherapy)して副作用を減ら
し抗癌効果を高めている。免疫療法に用いられる物質としてはインターロイキン－２のようなサイトカインがある。インターロイキン－２は免疫治療剤として治
療効果が優れ、特に癌移転に優れた治療効果を見せている。しかし、人体に応用して癌治療をする場合には高い濃度で用いなければならないが、この際、甚だし
い副作用を誘発する欠点がある。最近、サイトカインでない免疫増強物質としてレンチナン、OK－４３２等が開発されており、これら物質は副作用無しに抗癌
作用を示している。

【０００５】一方、ペリヌス菌株の微生物学的又は遺伝学的特性を糾明して報告した研究も皆無の実情であ
る。微生物の場合、同一の種(species)であっても各菌株が生産する活性物質の種類や生産量等に著しい差異があるのみならず、培養条件、菌株の安定
性、遺伝的変異の頻度等にも大きな差異をみせている。従って、強力な免疫抗癌活性物質を多量に生産すると共に、人工液体培養が可能であり、遺伝的変異が少
ない安定した微生物の選抜が最も重要な要因になる。すっぽん茸類は形態的にも顕微鏡下での変かが甚だしく多様であるため、それらの分類は顕微鏡下での形態
学的差異に依存しているのが実情である。

【０００６】最近、集団遺伝学と系統遺伝学においては、ＤＮＡ分析法が多く利用される。そのうち、
ＲＦＬＰ(restriction fragment Length
polymorphism)は、塩基配列の変異の推定を可能にする方法であって(Dowling et al.,
1990)、このＤＮＡ分析法は表現型による分析方法とは異なり遺伝子型を進化速度や遺伝傾向に基づき分析することができる長所を有している
（Dowling et al., Nucleic acid II: Restriction site analysis. In:
Molecular systematics ed. by D.M. Hills and C. Moritz, pp.250-317,
Sinauer Associates
Press）。ところで、ＤＮＡ分析の場合、核のＤＮＡはあまり大きく分析が容易でないという欠点があるため、主にオルガネラゲノム
(organellar genome)を多く用いる(White and
Densmore,1992)。そのうちでもミトコンドリアＤＮＡを多く利用するが、一般的にミトコンドリアＤＮＡは核のＤＮＡより大きさが小さく、進化
的変化速度が相対的に早く、母系半数体遺伝をするため、集団の遺伝子構造と歴史の研究によく使用される。特に、ミトコンドリアＤＮＡのＲＦＬＰは諸種間の
種間変異研究に用いられている(Foster et al., 1987,1988)。

【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、前記の如き事実を鑑み免疫増強活性を示す新規の多糖類物質を生産するペリヌス属菌株、この多糖類物質、及
び免疫疾患治療剤としての前記多糖類物質を提供することにある。本発明の別の目的は、免疫増強活性を示す新規の多糖類物質を生産する前記ペリヌス属菌株の
ミトコンドリアＤＮＡを制限酵素で処理し、ＲＦＬＰパターンを調べて同定した後、この菌株の菌糸体及び子実体から免疫増強活性多糖類物質を分離精製するこ
と、ならびに、分離精製した多糖類物質を癌、ＡＩＤＳなどの免疫関連疾患の予防・治療及び基礎的機序研究のための薬物として使用することにある。

【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の前記目的を達成するために、先ず、多様なペリヌス属菌株を培養してSDS-Phenol法でＤＮＡを分離した後、こ
のうちミトコンドリアＤＮＡだけを分離して制限酵素BamHI、ClaI、EcoRI及びPvuIIでそれぞれ処理し、処理された試料をアガロースゲル(Agarosegel)上で電気泳動した。ペリヌス属菌株間のＤＮＡ近縁関係をNeiとLiの方法(1979)により分析及び調査して近縁関係があると判断された新規の菌株ペリヌス・リンテウス・ユーKCTC0399BP菌株の子実体に対する微生物学的特性を調べた。菌株の子実体及び菌糸体から多糖類物質を抽出及び精製し、免疫増強活性を測定して免疫増強活性物質であることを確かめ、この免疫増強活性物質を精製した後、構成単糖類及び構造的特徴を調べ、免疫増強活性多糖類物質の構造分析を行った。次いで、ペリヌス属に属する各種の菌株を前記ペリヌス・リンテウス・ユー菌株KCTC
0399BPと同一の方法で培養し、菌糸体又は子実体から多糖類物質を抽出・精製した後、前記免疫増強活性測定法と同一の方法で免疫増強活性を調べて、ペリヌス属菌株に属する他の菌株からも免疫増強活性多糖類物質が分離されることを確認した。

【０００９】また、動物試験において、前記免疫増強活性多糖類物質をマウスの皮膚癌細胞が移植されたマウスに投与して抗癌活性を調べ、同一の方法で前記多糖類物質と化学薬剤を併用して、抗癌活性を調べた後、人体癌細胞に対する抗癌効果を調べた。次いで、皮膚癌細胞を尾静脈に移植した後、化学薬剤と前記免疫増強活性多糖類物質で処理して癌転移に及ぼすこれらの影響を調べ、これにより化学薬剤と前記多糖類物質が示す抗癌作用の機序の違いが判明した。

免疫活性多糖類物質の製造方法

【００１０】従って、本発明は以下のように要約される。 （１）免疫増強活性多糖類物質を生産し、ミトコンドリアＤＮＡの大きさが６１ｋｂであることを特徴とするペリヌス・リンテウス・ユー(Phellinus
linteusYoo) KCTC 0399BP菌株。 （２）ペリヌス属菌株の培養菌糸体又は子実体から抽出・精製して得られた免疫増強活性多糖類物質。

【００１１】
（３）前記天然物質がマンノース、ガラクトース及びグルコースで構成されることを特徴とする上記（２）記載の多糖類物質。
（４）ペリヌス菌株をグルコース、酵母抽出物およびペプトンを含む培地で培養して菌糸体又は子実体を得る工程、該菌糸体または子実体を熱水で抽出する工
程、エタノールで沈澱して沈殿物を得る工程、該沈殿物を水に懸濁し、透析膜で透析して免疫増強活性分画を得る工程、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィー
等のアニオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを順次に行って免疫活性多糖類物質を分離精製する工程を含む、免疫活性多糖類物質の製造
方法。

【００１２】（５）ペリヌス属菌糸体又は子実体から得られた多糖類物質又はその誘導体を有効成分として含む抗癌免疫増強活性医薬組成物。
（６）上記（２）または（３）記載の多糖類物質の、抗癌免疫治療剤としての使用。 （７）上記（２）または（３）記載の多糖類物質の、癌、ＡＩＤＳ等の免疫関連疾患治療剤としての使用。

【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の新規の菌株、多糖類物質とその製法，医薬組成物についてさらに詳細に説明する。新規菌株ペリヌス・リンテウス・ユー菌株
KCTC 0399BPを含むペリヌス属(Phellinus)菌株の１３種をポテトデキストロースアガー(Potato dextrose
agar:PDA)培地でそれぞれ培養する。培養されたそれぞれの菌糸体から全ＤＮＡをSDS-フェノール法で分離する。ミトコンドリアＤＮＡは株間の近
縁性を分析するのに有用である。前記分離された全体ＤＮＡからミトコンドリアＤＮＡを分離する段階；前記分離されたミトコンドリアＤＮＡを制限酵素で消化
し、この制限酵素消化されたＤＮＡをアガロースゲル(Agarose
gel)電気泳動にかけて各断片に分離する。前記電気泳動結果に従って距離移動を調べて制限酵素断片類似度(Ｆ値)を求めた後、この値を利用して塩基位置
当り塩基置換度(Ｐ値)を求めて実験に用いた菌株の近縁関係を分析及び調査する。前記調査により本発明の新規の菌株ペリヌス・リンテウス・ユー菌株
KCTC
0399BPが見出されたが、その子実体に対する微生物学的特性を調査して、この菌株の増殖に役立てる。本発明の新規の菌株を培養して，治療に有効である
と考えられる多糖類物質を抽出(特に，熱水抽出)・精製する。精製物が多糖類であることは、フェノール‐硫酸法、Folin‐フェノール法によって分析さ
れる。免疫増強活性多糖類物質の構成単糖類成分を分析し、また免疫増強活性多糖類物質の構造的特徴をＮＭＲ法で調査する。

【００１４】前記抽出・精製した多糖類物質を動物に投与後，リンパ球数をカウントしおよびリンパ球の増殖を測定することによって免疫増強活性を測定する。前記ペリヌス・リンテウス・ユー菌株KCTC
0399BPと同様に他のペリヌス属菌株を培養、菌糸体抽出、物質単離した後、免疫増強活性、抗癌免疫活性を測定する。ペリヌス属菌株子実体から多糖類物質を得て、免疫増強活性、抗癌免疫活性を測定する。

【００１５】
多糖類物質の抗癌活性をアッセイするためには、マウス由来皮膚癌細胞をマウスに移植し、次いで免疫増強活性多糖類物質を投与した後、マウスの生存率を調べ
る。また、アドリアマイシン等の抗癌剤を多糖類物質と共に投与した後、生存率を調べてそれぞれの抗癌活性を調べる。ヒト由来癌細胞をヌードマウスに移植
し、多糖類物質及びアドリアマイシンを単独かまたは組合せて投与して抗癌効果を調べる。マウス由来皮膚癌細胞をマウスの尾静脈に移植し、次いで免疫増強活
性多糖類物質およびアドリアマイシンを投与して癌転移抑制効果を調べる。マウス皮膚癌細胞とヒト肺癌細胞を多糖類物質とアドリアマイシンで単独かまたは組
合せて処理した後、スルフォローダミンB(Sulforhodamin
B)法で生存するマウス皮膚癌細胞を測定して癌細胞に対する細胞毒性を測定する。

【００１６】本発明
に用いたペリヌス・リンテウス・ユー菌株は、本発明者らにより微生物国際寄託機関である韓国科学技術研究院生命工学研究所遺伝資源センターに１９９７年
１１月１７日付で寄託番号KCTC
0399BPとして寄託された菌株である。この菌株及び他のペリヌス属菌株の免疫増強活性測定は、Ｂリンパ球の場合、生命工学研究所遺伝資源センター実験
動物研究室から分譲受けたB6C3Fマウスから摘出した脾臓の細胞(splenocyte)を各試料と陽性対照のＬＰＳ
(lipopolysaccharide)で処理して２日間免疫化した後、形成された抗体を分光光度法により測定して活性の指標とした。Ｔリンパ球の増殖
に対する多糖類物質の作用は混合リンパ球応答法で測定した。リンパ球の増殖効果は、細胞内の核ＤＮＡ合成程度を同位元素（トリチウム）で置換したチミジン
(3H‐ Thymidine)を用いて測定して活性の指標とした。

【００１７】以下、本発明の具体的な構成と作用を実施例を挙げて説明するが、本発明の権利範囲は下記実施例にのみ制限されるのではない。

【００１８】 【実施例】実施例１：ペリヌス菌株培養供試菌株は、表１に示した多様なペリヌス属菌株であって、これらをそれぞれポテトデキストロースアガー(potato
dextrose agar:PDA)培地で２８℃に維持しながら５～１２日間培養した後、４５０ｍｌのＰＤブロス(broth)に接種して、２８℃、１２０rpmの条件で１２日間振盪培養した。
【００１９】 【表１】 　省略

【００２０】実施例２：全ＤＮＡの分離菌糸体からの全ＤＮＡの分離はSDS-
フェノール法を利用した。前記実施例１において培養が終った菌糸体それぞれを、20mM EDTAで洗浄した後、フィルターペーパー(filter
paper;Waterman
no.1)を用いた真空濾過法により得て、－７０℃で氷らせて凍結乾燥した。凍結乾燥された菌糸体はすり鉢で細粉砕して粉末にした後、２ｇを計って
２０ｍｌの抽出緩衝溶液(extraction buffer;0.2M Tris・HC1, PH 8.5, 0.25M NaCl, 25mM
EDTA, 0.5%(w/v)
SDS)に入れてフェノール１４mlとクロロホルム６mlを加えて緩やかに振る。遠心分離して上澄液だけを取った後、RNアーゼ
A(10mg/ml)１５μｌを添加して３７℃で３０分間反応させ、プロテイナーゼＫ(Proteinase
K)(10mg/ml)１５μｌを添加して、６０℃で１５分間反応させた。反応後、同一容量のフェノール：クロロホルム：イソアミールアルコール(25:
24:1)を加えて良く混ぜて、４℃、12000ｘgで３０分間遠心分離して上澄液を取った、分離した上澄液に同量のクロロホルム:イソアミールアルコー
ル(24:1)を入れて良く混ぜた後、同一条件で遠心分離して上澄液を得た。この溶液に0.54容のイソプロパノール(isopropanol)を添加
し、同一条件で遠心分離してＤＮＡペレット(pellet)を得た。ＤＮＡペレットは７０％エタノールで洗浄して空気中で乾燥し、8mlのTE緩衝溶液
(10mM Tris・HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)に溶かして－２０℃で保管し使用した。
実施例３：ミトコンドリアＤＮＡの分離前記実施例２で分離された菌株それぞれの全ＤＮＡからミトコンドリアＤＮＡを得るために超遠心分離をした。即ち、
8mlのＤＮＡ溶液に8.8gの塩化セシウム(Cesium chloride;Sigma, U. S.
A)と6μlのビスベンズイミド溶液(bisbenzimidesolution)(10mg/ml)を混合し、２０℃、40000ｘgの条件で４０時間
超遠心分離した。超遠心分離後、紫外線灯下で現われる二つのＤＮＡバンドのうち上バンドだけを２１ゲージ(gauge)注射針で回収した。回収したミトコ
ンドリアＤＮＡ分画はビスベンズイミド(bisbenzimide)を除去するために飽和塩化セシウムイソプロパノール(CsCl-saturated
isopropanol)を同一容量で添加した後、弱くボルテキシング(Vortexing)し、４℃で1200ｘgに遠心分離して６～７回洗浄した。塩
化セシウムを除去するためにミトコンドリアＤＮＡ分画に３倍容の７０％エタノールを添加して４℃で100×gで10分間遠心分離してミトコンドリアＤＮＡ
を沈澱させた。ミトコンドリアＤＮＡは７０％エタノールで更に洗浄した後、常温で乾燥してTE buffer(PH
8.0)に溶かし、分光光度計(DU-64 Spectrometer Beckman, U.S.
A)で260nmの波長で定量して－２０℃で保管し使用した。
実施例４：ミトコンドリアＤＮＡの制限酵素消化本実施例の実験に用いた制限酵素及び緩衝溶液は、Boehringer
Mannheim(独国)から購入し、制限酵素とそれらの認識部位は表２に示した。前記実施例３で得た菌株それぞれのミトコンドリアＤＮＡ試料は、制限酵
素反応溶液10μlに1μgになるように用い、３７℃で３時間反応させた。 【００２１】 【表２】 　　省略

【００２２】実施例５：アガロースゲル(Agarose gel)電気泳動前記実施例４で制限酵素反応が終った試料は、ゲルローディング緩衝溶液(gelloading
buffer;0.25% ブロモフェノールブルー（bromophenol blue）, 0.25%キシレンシアノールFF, 30%グリセロール水溶液)と混合して電気泳動した。電気泳動は水平電気泳動装置(BRL,
U. S. A)を用いて1%アガロースゲル(agarose MP,Boehringer Mannheim co.，独国)でTAE緩衝溶液(40mM
Tris-acetate, 1mM EDTA, pH 8.0)を使用して５０Ｖで４時間実施した。展開後のゲルは臭化エチジウム(ethidium
bromide;0.5μg/ml水溶液)で染色した。表３に各菌株のミトコンドリアＤＮＡの大きさをまとめて示した。

【００２３】
【表３】 　　省略

【００２４】
実施例６：ＲＦＬＰ(restriction fragment length
polymorphism)分析ペリヌス属菌株間のＤＮＡ近縁関係の分析及び調査は、NeiとLiの方法(1979)により行った。即ち、制限酵素で消化
した各菌株のミトコンドリアＤＮＡ断片を前記実施例５で説明した通り、アガロースゲルに電気泳動し、等距離で移動するＤＮＡ断片を同一のものと仮定して制
限酵素断片類似度（Ｆ値）と塩基位置当り塩基置換度（Ｐ値）を求め、Ｐ値からペリヌス・リンテウス・ユー菌株KCTC
0399BPと他のペリヌス属菌株との近縁関係をUPGMA(Unweighted Pari-Group Method,arithmetic
average)Clustring方法により分析した。Ｐ値とＦ値は下記式に基づき計算した。 制限酵素断片類似度
F=2nxy/(nx+ny)(nx、nyは各菌株x、yのDNA断片の総数、nxyは二つのペリヌス菌株間の共通DNA断片数)塩基位置当り塩基置換度
P=-(1nF)/r(rは制限酵素認識部位の塩基対数)表４に、制限酵素BamHIで処理した各菌株のＦ値とこれに相応するＰ値を、又、表５には制限酵
素CIaIで処理した各菌株のＦ値とこれに相応するＰ値を、表６には制限酵素EcoRIで処理した各菌株のＦ値とこれに相応するＰ値を、表７には制限酵素
PvuIIで処理した各菌株のＦ値とこれに相応するＰ値を示し、そして表８には共通切片の比率と表４～７の斜線上Ｐ値に相応する算術平均的な距離を示し
た。又、この結果により図１（省略）のような進化系統図を作成し、これに従って本発明の新規の菌株ペリヌスリンテウスユー菌株KCTC
0399BPは、ペリヌス属菌株と有縁関係がある新たに分化された菌株であることを示した。

【００２５】 【表４】 　　省略

【００２６】
【表５】 　　省略

【００２７】 【表６】 　　省略

【００２８】 【表７】 　　省略

【００２９】 【表８】 　　省略

【００３０】
実施例７：本発明ペリヌス・リンテウス・ユー(Phellinus linteus
Yoo)菌株KCTC0399BPの微生物学的特性調査前記実施例１～６までの結果から、ペリヌス属菌株と近縁関係がある、新たに分化された新規の菌株で
あるのが証明された本発明の新規の菌株の微生物学的特性を調べた。この菌株の子実体は、無柄であり多年生で木質部分が形成されており、笠は半円形で幅
10cm、厚さ約4cmであった。採取した桑黄茸の表面は、初めには暗褐色を呈していたが、後には黒褐色に変化し、多くの巨裂を呈し荒かった。下面は初め
には鮮黄色を帯びた後、黄褐色に変った。下面の管孔は多層であり、孔の入口は微細であり、胞子は類球形、淡黄褐色で3～4μm、剛毛体は多数であり、厚膜
は15～30×8～10μmであった。

【００３１】実験の結果、この菌株は日本で発行された「原色日本新菌類図鑑(II)、Hoikusha
発行、イマゼキロクヤ及びホンゴーツコウ編著p189」に記録された桑黄茸(Phellinus
linteus)と殆ど一致するが桑黄茸の新菌株と認め、本発明者らはこの菌株の菌株名をペリヌス・リンテウス・ユー(Phellinus
linteus Yoo)と命名した。前述した通り、この菌株は韓国科学技術研究院生命工学研究所に１９９７年１１月１２日付寄託番号KCTC
0399BPで寄託された。 実施例８：ペリヌスリンテウスユー菌株(Phellinus linteus Yoo;KCTC
0399BP)の培養本発明の新規のペリヌス・リンテウス・ユー菌株を液体培養するために培地１リットル当り葡萄糖50g、ペプトン10g、酵母抽出物
10g及びKH2PO4 0.8g、MgSO4・7H2O 0.5g、CaCl2
0.3gを混合した無機塩類溶液1mLが入っている液体培地をpH6.0に調整した後、滅菌して用いた。この際、菌糸体を培養するために5リットル発酵槽
を用いて3.5リットルの液体培地を作り、温度２８℃、通気量2vvm、回転数160rpm条件で１１日間培養し、この際の菌糸体収率は５日後に最も高
く、リットル当り30gであった(図２　省略)。５日間培養した菌糸体の熱水抽出で得られる多糖類物質の収率は、表９から見られる通り、菌糸体乾燥重量当
り0.873％であった。

【００３２】 【表９】 　　省略

【００３３】実施例９：ペリヌス・リンテウス・
ユー菌株の培養菌糸体抽出本発明の新規のペリヌス・リンテウス・ユー菌株の培養菌糸体を次のような方法により抽出・精製して免疫増強活性粗抽出物を得た。
前記実施例８で得られた培養菌糸体280gを熱水抽出した後、濃縮して3gの熱水抽出液を得た。この抽出液にエタノール濃度が80%になるようにエタノー
ルを加えた後、４℃で２４時間放置した後に遠心分離して、上澄液と沈澱物を得た。沈澱物は水に溶かした後、透析膜(cellulose
tubing,日本三光純薬製品)を用いて１０℃低温で７２時間の間に１２時間間隔で透析液を交換しながら透析した。透析膜内の内液を凍結乾燥して
2.45gの粗抽出物を得た。
実施例１０：純粋な免疫活性物質の分離前記実施例９で得られた粗抽出物をDEAE-セルロースとゲル濾過クロマトグラフィーを順次に行って純粋な活性分画
を得た。先ず、粗抽出物を5mMソジウムホスフェート緩衝液(pH
7.2)に溶解した後、DEAE-セルロースカラムにアプライし、同一緩衝溶液で洗浄した後、同一緩衝溶液に0から1M濃度のNaClを調製して
gradientで１分当り5mLの流速で溶出させて各試験管に15mLずつ分取した。フェノール－硫酸定量法より糖含量を、ブラッドフォード法により蛋
白質含量を決定した。この際、得られた糖含量粗抽出物分画はToyopearl HW
65Fゲル濾過クロマトグラフィーにかけて分子量が均一で性質が同一な純粋活性分画を得た。溶出は水で行った。糖と蛋白質含量は前記の同一な方法で決定し
た。このようにして得られた純粋な免疫活性物質をピーエル(PL)とし、抽出及び精製過程は図３（省略）に示した。実施例１１：抽出分画多糖類物質の免疫
増強活性の調査担子菌由来の多糖類物質は、生体内の免疫機構であるリンパ球の増殖又は活性に影響を与えることにより外部因子に対する免疫性を増強させ、こ
の結果、癌細胞の破壊をもたらすと知られている。このような作用は直接的な細胞毒性に起因するのではなく、免疫活性により媒介されるもので、生体内の副作
用が少ない長所がある。即ち、T-細胞とB-細胞リンパ球のそれぞれに対する細胞毒性作用と免疫作用体である抗体形成を誘導して免疫活性が増加し、その結
果として免疫抗癌活性を示す。従って、抗体形成リンパ球をカウントし、リンパ球とT-細胞の増殖程度を測定することにより、免疫抗癌活性を間接的に説明す
ることができる。

【００３４】本発明においては抗体形成リンパ球をカウントする抗体形成細胞計算法(antibody forming cell method)、T-細胞の増殖程度を測定する混合リンパ球応答(Mixed
lymphocytes response)とリンパ球の増殖効果が判る細胞内の核ＤＮＡ合成量を同位元素で置換されたチミジン(3H
‐Thymidine)を用いて測定することにより、活性の指標とした。実験結果は表１０に示した。

【００３５】 【表１０】 　　省略

【００３６】
本発明の新規のペリヌス・リンテウス菌糸体から得た多糖類物質は、対照区に比べて約５倍高いリンパ球増殖及びT-細胞活性効果を示し、B細胞の抗体形成能
の場合、免疫諸剤のうち効果が最も優れているが、生体内の副作用に因り用いることができない陽性対照区リポポリサカライドの活性程度とは殆ど類似の水準を
示した。
実施例１２：免疫増強活性多糖類物質の構成糖単位及び糖組成の調査実施例１０で得た多糖類物質の構成単糖類成分を分析するためにガスクロマトグラフィーを
実施した(図４　省略)。更に、構成成分は炭水化物の場合、フェノール‐硫酸法により測定し、蛋白質の場合、Folin－フェノール法により測定した。分
析機種として、ヒューレットパッカード(HP 5890 GC)を用い、カラムはヒューズドシリカキャピラリカラムＳＰ－2330(fused
silica capillary column sp-2330, 0.32mm x
30cm)を用いた。下記条件でガスクロマトグラフィーを行った。カラム温度を初期に２００℃で２分間維持した後、１分間隔で４℃ずつ温度を高めて最終温
度が２５０℃で２分間維持されるようにして測定し、ディテクター(detector)の温度は２６０℃、注入部(injector)の温度は２５０℃に維
持した。実施例１１で得た各抽出分画多糖類物質2mgずつをTFAで加水分解し、ソジウムボロハイドライド(NaBH4)で還元した後、無水酢酸でアセチ
ル化してアジトールアセテート(aditol acetate)とし、前記の条件でガスクロマトグラフィーを実施した。その結果を下記表１１に示した・

【００３７】 【表１１】

【００３８】
実施例１３：免疫増強活性多糖類物質の構造分析免疫増強活性多糖類物質の構造分析を実施した。先ず、純度をHW
65Fゲルカラムクロマトグラフィーによって確めた。このクロマトグラフィーで単一対称ピークを示したのでPLが純粋であることが確認された(図５　省
略)。炭素核磁気共鳴スペクトル分析の結果(図６　省略)、グルコース単位がα(１→４)及びβ(１→６)結合によって結合された長鎖を形成し、この長鎖
にマンノースとガラクトースが分枝として結合されたガラクトマンノグルカン(Galactomannoglucan)と同定された。

【００３９】以上の結果、構成単糖類成分結果とよく一致し、抽出分画単糖類がβ-グルカンとは構造が相
違する新規の多糖類物質であることが判明した。
実施例１４：ペリヌス属菌株培養菌糸体の抽出、精製及び免疫増強活性調査前記実施例８～１１まで実施した方法と同様にペリヌス属に属するペリヌス・イグニ
アリウス(Phellinus igniarius)、ペリヌス・バウミ(P. baumi)、ペリヌス・ピニ(P.
pini)、ペリヌス・ギルブス(P. gilvus)及びペリヌス・ニグリカンス(P.
nigricans)を培養し、菌糸体を得、多糖類物質を抽出・精製した後、これらを使用してT-細胞とB-細胞リンパ球のそれぞれの細胞毒性作用と免疫
作用体である抗体形成の増強を誘導した。抗体形成リンパ球をカウントし、またT-細胞の増殖程度を測定して抗癌免疫活性を間接的に証明した。結果は、前記
実施例１１と殆ど同じであることが分かった。
実施例１５：ペリヌス属菌株子実体の抽出、精製及び免疫増強活性調査前記実施例８～１１まで実施した方法と同様にペリヌス属に属するペリヌス・イグニアリ
ウス(Phellinus igniarius)、ペリヌス・バウミ(P. baumi)、ペリヌス・ピニ(P.
pini)、ペリヌス・ギルブス(P. gilvus)及びペリヌス・ニグリカンス(P.
nigricans)菌株を培養し、子実体を収得して多糖類物質を抽出・精製した後、これらを使用してT-細胞とB-細胞リンパ球のそれぞれの細胞毒性作
用と免疫作用体である抗体形成の増強を誘導した。抗体形成リンパ球をカウントし、T-細胞の増殖程度を測定して抗癌免疫活性を間接的に証明した。結果は、
前記実施例１１と殆ど同じであることが分かった。
実施例１６：投与時間による多糖類物質の癌細胞に対する抗癌活性調査多糖類物質の抗癌活性は、マウス由来癌細胞であるB16F10皮膚癌細胞を利用して測
定した。B16F10皮膚癌細胞は10%の血清を含有したRPMI1640培地で培養し、１週に２回程継代培養した。B16F10皮膚癌細胞は、BDF1
マウス当り100,000細胞を移植して、３０日間マウスの生存率を調べた。多糖類物質を癌細胞移植１週間前から癌細胞移植後１２日まで持続的に腹腔投与
する前処置を行い生存率を調べ、一方癌細胞を移植した後１２日間多糖類物質を腹腔投与する後処置を行い生存率をそれぞれ調べた。実験の結果、図７（省略）
に示す通り、未処置群の生存率が最も少なく、次が多糖類物質後処置群、その次の多糖類物質前処置群であることが分かった。これを表１２にまとめた。
B16F10皮膚癌細胞を移植したマウスの場合、平均生存が２０.８日であり、多糖類物質を前処置した場合には平均生存が２９日であり、多糖類物質を後処
置した場合には２５.８日であった。この際、試験マウスに体重の変化はなかった。